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詳細內(nèi)容
牛鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)檢測試劑盒
(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)
適用生物：牛
使用說明書
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!
[檢測范圍]
0.313-20ng/mL
[靈敏度：最小可測]
0.135ng/mL
[預期應用]
本試劑盒運用雙抗體夾心 ELISA 法定量檢測牛血清、血漿、組織勻漿或其它相關(guān)生物液體中鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)含量。
[牛鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)檢測試劑盒內(nèi)容]
| Reagent | Quantity |
| 酶標包被板 | 12well×8strips |
| 標準品 | 1×0.5ml |
| 標準品稀釋液 | 1×1.5ml |
| 酶標試劑 | 1×6ml |
| 樣品稀釋液 | 1×6ml |
| 顯色劑A液 | 1×6ml |
| 顯色劑B液 | 1×6ml |
| 終止液 | 1×6ml |
| 30倍濃縮洗滌液 | 1×20ml×30flod |
| 說明書 | 1 |
| 封板膜 | 2 |
| 密封袋 | 1 |
[需自備的設(shè)備及試劑]
1、450±10nm 濾光片的酶標儀(建議儀器使用前提前預熱)
2、單道或多道微量加液器及吸頭
3、稀釋樣品的 EP 管
4、蒸餾水或去離子水
5、吸水紙
6、盛放洗液的容器
[試劑盒的儲存及有效期]
1、未開封的試劑盒：所有試劑均按試劑瓶標簽上所示保存。請注意，收到試劑盒后請盡快將標準品、檢測溶液 A、檢測溶液 B 以及 96 孔板保存于-20oC。
2、使用后的試劑盒：剩余試劑仍需按照試劑瓶標簽所示的溫度保存，開封后的酶標板要加干燥劑后密封保存于-20oC，避免潮濕。
注意：
試劑盒內(nèi)酶標條可拆卸，按實驗需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在首次實驗后 1 個月內(nèi)使用完畢。產(chǎn)品過期時間以盒子上的標簽為準，保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。
[牛鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)檢測試劑盒標本的采集與保存]
1、血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置 2 小時或 4oC 過夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20oC 或-80oC 保存，但應避免反復凍融。
2、血漿：用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的 30 分鐘內(nèi)于 2-8oC 1000×g 離心 15 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20oC 或-80oC 保存，但應避免反復凍融。
3、組織勻漿：
1）取適量組織塊，于預冷 PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；
2）可同時選用多種勻漿方法達到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入 5-10mL 預冷 PBS 進行充分研磨，該過程需在冰上進行（有條件實驗室可選用機器勻漿）；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復凍融進一步處理（超聲破碎過程中注意冰浴降溫；反復凍融法可重復 2 次）。
3）將制備好的勻漿液于 5000×g 離心 5 分鐘，留取上清即可檢測。
4、其它生物標本：請 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20oC 或-80oC 保存，但應避免反復凍融。
注意：
1、以上標本均需密封保存，4oC 保存應小于 1 周，-20oC 不應超過 1 個月，-80oC 不應超過 2 個月。
2、標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
3、標本使用前應緩慢均衡至室溫，不應加熱使之融解。
[試劑準備]
1、使用前將所有的試劑和標本緩慢均衡至室溫(18-25oC)，試劑不能直接在 37oC 溶解。
2、標準品(凍干品)：每瓶標準品加入標準品稀釋液 1mL，蓋好后室溫靜置大約 10 分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為20ng/mL。準備 7 個稀釋標準品的 EP 管，每個 EP 管中加入 500μL 的標準品稀釋液，比如圖所示依次倍比稀釋成 20ng/mL-10ng/mL-5ng/mL-2.5ng/mL-1.25ng/mL-0.625ng/mL，標準品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
3、檢測溶液 A 及檢測溶液 B：Detection A 及 Detection B 在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測稀釋液 A 或 B1:100 稀釋(如：10μL 檢測溶液 A/990μL 檢測稀釋液 A)，充分混勻，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(100μL/孔)，實際配制時應多配制0.1-0.2mL。
4、濃洗滌液：用 580mL 蒸餾水或去離子水將 20mL 濃洗滌液稀釋至 600mL，進行 30 倍稀釋。
5、底物溶液：請用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的 TMB 至另一干凈容器中使用，容器中剩余的底物應予丟棄，不要倒回 TMB 瓶中。
牛鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)檢測試劑盒注意：
1、標準品的稀釋不能直接在板中進行。
2、標準品請于臨用前 15 分鐘內(nèi)配制。該標準品只能使用一次。
3、標準品、檢測溶液 A 工作液、檢測溶液 B 工作液請使用相應的稀釋液配制，不能混淆。混勻時要輕輕充分混勻，避免起泡。為保證實驗結(jié)果的準確請使用微量吸管，并校準微量加液器。請依據(jù)所需的量精確配制，盡量不要微量配制(如吸取檢測溶液 A 時，一次不要小于 10μL)，以避免造成濃度誤差。
4、請勿重復使用已經(jīng)稀釋過的標準品、檢測溶液 A 工作液和檢測溶液 B 工作液。
5、濃洗滌液中如有結(jié)晶析出，請先溫育至室溫，輕輕混勻，至到結(jié)晶完全溶解再進行配制。
6、試劑盒中部分試劑為儲存液，客戶需配置成工作液后使用，在配置過程中如因純凈水質(zhì)量差或水質(zhì)污染，以及實驗中所用耗材潔凈度差，可能造成實驗結(jié)果不準確，甚至完全錯誤，請使用雙蒸水。
[標本處理]
1、本公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。
2、實驗前應預測標本含量，如果標本濃度過高，應對標本進行稀釋，使稀釋后的標本符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數(shù)。標本0.01mol/L 的 PBS 稀釋(PH=7.0-7.2)。
3、若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進行預實驗驗證其有效性，并注意留存樣本。
4、使用化學裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學物質(zhì)的引入導致 ELISA 實驗結(jié)果偏差。
5、若樣本為細胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素 較多，如：細胞狀態(tài)、細胞數(shù)量、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。
6、某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。
7、建議使用新鮮樣本，保存時間過長可能會存在蛋白降解或變性導致實驗結(jié)果偏 差。
[牛鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)檢測試劑盒操作步驟]
1、加樣：分別設(shè)標準孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標準孔 7 孔，依次加入 100μL 不同濃度的標準品(見試劑準備 2)。空白孔加 100μL(見試劑準備第二步最后一管)，余孔加待測樣品 100μL，酶標板加上覆膜，37oC 溫育 2 小時。
2、棄去液體，甩干，不用洗滌。
3、每孔加檢測溶液 A 工作液 100μL(臨用前配制)，酶標板加上覆膜，37oC 溫育 1 小時。
4、棄去孔內(nèi)液體，每孔用 350μL 的洗滌液洗滌，浸泡 1-2 分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)，重復洗板 3 次。最后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。自動洗板機亦可。
5、每孔加檢測溶液 B 工作液(臨用前配制)100μL，加上覆膜，37oC 溫育 30 分鐘。
6、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 4。
7、每孔加底物溶液 90μL，酶標板加上覆膜，37oC 避光顯色(反應時間控制在 15-25 分鐘，不要超過 30 分鐘。當標準孔的前 3-4 孔有明顯的梯度藍色，后 3-4 孔梯度不明顯時，即可終止)。
8、每孔加終止溶液 50μL，終止反應，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。
9、在確保酶標板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度(O.D.值)。
注意：
1、試劑準備：準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。
2、加樣：實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡，將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時，第一個孔與最后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。因此，一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)最好控制在 10 分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復孔進行實驗。
3、溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài)，同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4、洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標儀讀數(shù)。如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實 驗過程中。
5、反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如，每隔 10 分鐘觀察一次)，如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。
6、底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7、如果實驗室內(nèi)濕度低于 60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。
[實驗原理]
將鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)抗體包被于 96 孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標準品或標本，其中的鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)與連接于固相載體上的抗體結(jié)合，然后加入生物素化的鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)抗體，將未結(jié)合的生物素化抗體洗凈后，加入 HRP 標記的親和素，再次徹底洗滌后加入 TMB 底物顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)呈正相關(guān)。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度(O.D.值)，計算樣品濃度。
[牛鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)檢測試劑盒計算]
各標準品及樣本 O.D.值扣除空白孔 O.D.值后作圖(七點圖)，如設(shè)置復孔，則應取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標(或?qū)?shù)坐標)，O.D.值為橫坐標(或?qū)?shù)坐標），繪出標準曲線(最佳方程式應依回歸方程計算的 R2值來定，以 R2值越趨近于 1 為好)。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.30，根據(jù)樣品 O.D.值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與 O.D.值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的O.D.值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
[典型數(shù)據(jù)]
為了便于計算，盡管濃度為自變量而 O.D.值為因變量，我們繪圖時仍采用標準品的 O.D.值作為橫坐標(X 軸)，標準品的濃度為縱坐標(Y 軸)。同時為了試驗結(jié)果的直觀性，圖中提供的是原始數(shù)據(jù)而非對數(shù)值。推薦使用對數(shù)值建立標準曲線圖。由于實驗操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和溫度條件等），標準曲線的O.D.值會有所差異。所提供的標準曲線僅供參考，實驗者需要根據(jù)自已的實驗建立標準曲線。此值為 20 個空白樣品(即標準品稀釋液)測定的平均值加二倍標準差所對應的濃度。
[特異性]
本試劑盒用于檢測鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)，經(jīng)檢測與其它相似物質(zhì)無明顯交叉反應。
由于受到技術(shù)及樣本來源的限制，不可能完成對所有相關(guān)或相似物質(zhì)交叉反應檢測，因此本試劑盒有可能與未經(jīng)檢測的其它物質(zhì)有交叉反應。
[回收率]
分別于定值血清及血漿樣本中加入一定量的鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)（加標樣品），重復測定并計算其均值，回收率為測定值與理論值的比率。
| 樣本 | 回收率范圍 | 平均回收率(%) |
| 血清（n=5) | 86-98 | 93 |
| EDTA血漿（n=5） | 91-103 | 96 |
| 肝素血漿（n=5） | 84-96 | 90 |
[線性]
在定值血清及血漿樣本內(nèi)加入適量的鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)，并倍比稀釋成 1:2，1:4，1:8，1:16 的待測樣本，線性范圍即為稀釋后樣本中鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)含量的測定值與理論值的比率。
| 樣本 | 1：2 | 1：4 | 1：8 | 1：16 |
| 血清（n=5) | 83-95% | 85-97% | 93-107% | 85-99% |
| EDTA血漿（n=5） | 95-105% | 91-102% | 89-99% | 93-104% |
| 肝素血漿（n=5） | 87-101% | 84-98% | 91-103% | 88-96% |
[精密度]
精密度用樣品測定值的變異系數(shù) CV 表示。CV(%) = SD/mean×100批內(nèi)差：取同批次試劑盒對低、中、高值定值樣本進行定量檢測,每份樣本連續(xù)測定 20 次，分別計算不同濃度樣本的平均值及 SD 值。
批間差：選取 3 個不同批次的試劑盒分別對低、中、高值定值樣本進行定量測定，每個樣本使用同一試劑盒重復測定 8 次，分別計算不同濃度樣本的平均值及 SD 值。
批內(nèi)差： CV<10%
批間差： CV<12%
[穩(wěn)定性]
經(jīng)測定，試劑盒在有效期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性降低率小于 5%。為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響，實驗室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實驗室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實驗員來進行操作可減少人為誤差。
[實驗流程]
1、實驗前標準品、試劑及樣本的準備；
2、加樣（標準品及樣本）100μL，37oC孵育2小時；
3、吸棄，加檢測溶液A100μL，37oC孵育1小時；
4、洗板3次；
5、加檢測溶液B100μL，37oC孵育30分鐘；
6、洗板5次；
7、加TMB底物90μL，37oC孵育15－25分鐘；
8、加終止液50μL，立即450nm讀數(shù)。
[牛鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)檢測試劑盒說明]
1、由于現(xiàn)有條件及科學技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風險。
2、最終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務必準備充足的標本備份。
3、不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進行實驗操作，網(wǎng)站電子版說明書僅作參考。
4、只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到最佳的檢測結(jié)果。
5、在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
6、剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。請勿提前將酶標板從包裝袋里拿出。
7、由于操作者不熟練、操作失誤或讀數(shù)儀程序選用錯誤等有可能會導致錯誤結(jié)果的產(chǎn)生。請使用者使用該產(chǎn)品前仔細閱讀說明書，調(diào)試好酶標儀，請使用配備有 450±10nm 濾光片的酶標儀，且該酶標儀測量范圍在0.001-3.000 O.D.或以上。
8、同一使用者在使用同一產(chǎn)品時，如不同時間訂購，也可能會因不同批次的少量差異產(chǎn)生不同結(jié)果，因此建議使用者在每次使用前均進行預實驗。
9、試劑盒在出廠前均經(jīng)過嚴格檢測，但由于運輸條件及各實驗室條件差異，可能會造成實驗結(jié)果與出廠結(jié)果不一致或不同批次試劑盒批間差大的情況，對于這種情況會酌情處理。
10、本試劑盒未與其他廠家同類試劑盒或不同方法檢測同一目的蛋白的產(chǎn)品做對比，平行檢測可能會存在檢測結(jié)果不一致的情況。
11、本操作說明同樣適用于 48T 試劑盒，但 48T 試劑盒所有試劑減半。
[警告]
本試劑盒中使用了稀硫酸作為終止液，其具有輕微腐蝕性，使用時應避免接觸衣物或眼、手等皮膚暴露部位。
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